細胞培養(yǎng)的成功很大程度上取決于保護細胞免受細菌、真菌和病毒等微生物的污染。非無菌物品、培養(yǎng)基和試劑、帶有微生物的空氣顆粒、不干凈的培養(yǎng)箱和污染的工作臺面均是導致微生物污染的來源。

無菌技術(shù)的作用是在環(huán)境微生物與無菌的細胞培養(yǎng)物之間形成一道屏障，它通過一套操作流程來降低培養(yǎng)物被上述污染源污染的可能。無菌技術(shù)的組成要素包括：無菌工作區(qū) 域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。

無菌工作區(qū)域

簡單、經(jīng)濟的減少空氣顆粒和氣體揮發(fā)（例如：灰塵、芽抱、皮屑、噴嚏）污染的方 法就是采用細胞培養(yǎng)通風櫥。

•細胞培養(yǎng)通風櫥應正確設(shè)置，放置于專門用于細胞培養(yǎng)的區(qū)域，同時要避免來自門、 窗及其他設(shè)備的氣流，不能有直接的來往通道。

•工作臺面應保持整潔，只放置特定實驗所需的物品；不能用作儲存區(qū)域。

•使用前后均應*消毒工作臺面，周圍區(qū)域和設(shè)備應定期清潔。

•常規(guī)清潔時，工作前和工作過程中，特別是發(fā)生潑濺后，應使用70%乙醇擦拭工作 臺面。

•使用完畢后，可用紫外燈對細胞培養(yǎng)通風櫥內(nèi)空氣和暴露在外的工作臺面進行消毒。

•在細胞培養(yǎng)通風櫥內(nèi)不需要也不建議使用煤氣燈火焰。

•細胞培養(yǎng)通風櫥應始終保持運轉(zhuǎn)，長時間不使用時方可關(guān)閉。

良好的個人衛(wèi)生

操作細胞培養(yǎng)物前后應洗手。穿戴個人防護設(shè)備不僅可保護您免受危險品污染，還可降 低皮屑以及衣服上污物和灰塵污染培養(yǎng)物的可能。

無菌試劑和培養(yǎng)基

商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制以確保其無菌性，但是在操作過程中這些產(chǎn)品 可能被污染。應遵循以下無菌操作原則以免污染。必須采用適當?shù)臏缇椒ǎɡ纾焊邏?蒸汽、無菌過濾）對實驗室中配制的所有試劑、培養(yǎng)基和溶液進行滅菌。

無菌操作

•必須用70%乙醇擦拭雙手和工作區(qū)域。

•在將容器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)通風櫥之前，必須用70%乙醇擦拭 其外部。

•不要從試劑瓶或培養(yǎng)瓶中直接傾倒培養(yǎng)基和試劑。

•使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體；每支吸管只能使用一次，以 免交叉污染。使用時方可打開無菌吸管的包裝。吸管應始終位于工作區(qū)域內(nèi)。

•試劑瓶和培養(yǎng)瓶用后必須蓋上，用膠帶將多孔板密封起來或者將其放入重復密封袋 中，以免微生物和空氣污染物進入，污染培養(yǎng)物。

•無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境 中。操作完成后盡快蓋上蓋子。

•取下蓋子時應將蓋子開口朝下放在工作臺面上。

•必須使用無菌玻璃器皿和其他設(shè)備。

•進行無菌操作時不要說話、唱歌或者吹口哨。

•盡快完成實驗，以盡量避免污染。

無菌技術(shù)核對表

工作區(qū)域

細胞培養(yǎng)通風櫥設(shè)置是否正確？

細胞培養(yǎng)通風櫥所在區(qū)域有無氣流和直接出入通道?

工作臺面是否整潔？是否僅僅放置了實驗所需的物品？

開始工作前用70%乙醇擦拭工作臺面了嗎？

是否定期對培養(yǎng)箱、冰箱、冰柜及其他實驗室設(shè)備進行清潔和消毒?

個人衛(wèi)生

您洗手了嗎？

您穿戴個人防護設(shè)備了嗎？

如果您留了長發(fā)，您把頭發(fā)扎在后面了嗎？

您是用移液器操作液體嗎？

試劑和培養(yǎng)基

您采用適當?shù)姆椒▽嶒炇抑信渲频乃性噭⑴囵B(yǎng)基和溶液進行滅菌了嗎？

在將容器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿放入工作臺面之前，您用70%乙醇擦拭其外部 了嗎？

試劑瓶、培養(yǎng)瓶及其他容器不使用時蓋緊了嗎？

是否已將所有培養(yǎng)板均放入無菌重復密封袋中？

是否有試劑外觀渾濁？是否被污染了？試劑中有漂浮顆粒嗎？有難聞氣味嗎？有顏 色異常嗎？如果出現(xiàn)上述情況，是否已對其進行去污并丟棄？

操作

您操作時是否緩慢、謹慎、注意無菌技術(shù)了？

在將移液器、試劑瓶和培養(yǎng)瓶放入細胞培養(yǎng)通風櫥之前，用70%乙醇擦拭其表面 了嗎？

是否將蓋子口朝下放置在工作區(qū)域？

您是使用無菌玻璃吸管或者一次性無菌塑料吸管操作液體嗎？

無菌吸管是否僅僅使用一次以免交叉污染?

您是否注意到避免使吸管尖-端觸碰到任何非滅菌物品包括瓶口螺紋的外緣?

發(fā)生液體潑濺時是否立即吸干并用70%乙醇擦拭該區(qū)域？