游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測(cè)血清、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞）

                                              微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動(dòng)物血液中的游離脂肪酸 (FFA )含量是一項(xiàng)重要的生理生化指標(biāo)。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)，游離脂肪酸的濃度會(huì)因?yàn)樘悄虿　⒅匕Y肝障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病而上升。

測(cè)定原理：

用有機(jī)溶劑萃取FFA。含有FFA的有機(jī)液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機(jī)相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFA一Cu。Cu離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與Cu離子濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。

自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

萃取液：液體 120 mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體 15 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體 15 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，室溫保存；

試劑四：液體 12 mL×1瓶，4℃保存；

樣本前處理：

1.動(dòng)物組織：按照動(dòng)物組織質(zhì)量（g）：萃取液mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL萃取液），進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取15min，5000 rpm 4℃離心5min，取有機(jī)相待測(cè)。

2.血清：吸取50 μL血清樣本，加入1 mL萃取液，震蕩提取15 min后，4℃，5000 rpm離心5 min，取有機(jī)相待測(cè)。

3.微生物、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：萃取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1 mL萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲2秒，間隔3秒，總時(shí)間3min）；震蕩提取15 min，然后5000 rpm 4℃離心5min，取有機(jī)相待測(cè)。

注意：有機(jī)相待測(cè)液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層即為有機(jī)相待測(cè)液。

測(cè)定步驟：

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550 nm。

2、   工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（mL）：1（mL）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空瓶中配制，試劑盒中帶有4個(gè)空瓶，先將試劑一與試劑二混合，最后再加入試劑三粉劑）

3、測(cè)定管：吸取600μL樣本，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取200μL上層有機(jī)相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測(cè)定550 nm的吸光值，記為A測(cè)定。

4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取200μL上層有機(jī)相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測(cè)定550 nm的吸光值，記為A空白。

空白管只需測(cè)一次。△A=A測(cè)定-A空白

注意：1、有機(jī)溶劑易揮發(fā)，加入96孔板后應(yīng)盡快檢測(cè)。

2、測(cè)定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機(jī)相待測(cè)液。

FFA含量計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0161x - 0.0141     R² = 0.9985   x：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）

                                            y：吸光值差值△A

1、血清FFA含量計(jì)算：

FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

                 =1.242×(△A+0.0141)

2、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞中FFA含量計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA含量(μmol/g鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W× V1÷V2）÷1000

                =0.062×(△A+0.0141)÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000

                =0.062×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入樣本體積，0.6mL；V2：萃取液體積，1mL；V3：加入血清（漿）體積，0.05 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：動(dòng)物組織樣品質(zhì)量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。

注意事項(xiàng)：

1.        蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機(jī)相待測(cè)液直接測(cè)定，可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒。

2.        Z低檢出限為20 nmol/mL。