甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）試劑盒說明書

                                         微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                           

MCS廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。

測(cè)定原理：

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體30mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g，4℃離心5min。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④        上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。

⑤        在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CS測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）在試劑五中加入1mL無水乙醇和22mL試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑五和10μL試劑六，混勻，記錄412nm處20秒時(shí)的初始吸光度A1和2分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

MCS活性計(jì)算：

a.        使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.3556×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b.       使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=355.6×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.711×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

配方：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存；（50mM Tris-HCl 7.4，8.56g 蔗糖，88mg EDTA）

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；(10mM Tris-HCl 7.4，1％Trixton-100)

試劑三：液體1.5mL×1支，4℃保存；(100mM PMSF)

試劑四：液體×1瓶，4℃保存；（稱0.135g Tris，0.166g KCl，8.4mgEDTA，溶于27.5mL雙蒸水，用HCl調(diào)pH至7.5）

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；（稱取2mg DTNB，2mg 丙二酰CoA于30mL試劑瓶）

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；（稱取0.6mg草酰乙酸于1.5mLEP管）