抗壞血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性測定試劑盒說明書

                                                    微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

AAO是定位于植物細胞壁的糖蛋白，屬“藍銅氧化酶"家族。細胞壁內的抗壞血酸和AAO與細胞壁的代謝和生長有著密切的聯系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過質膜上的細胞色素b還原，該過程中電子的跨膜運輸能夠促進細胞生長。

測定原理：

AAO可直接氧化AsA，通過測定AsA的氧化量，可計算得AAO活力。

實驗中所需儀器及設備：

低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調式移液器、研缽、冰、蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

AAO測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到265 nm。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL預熱的試劑二和10μL試劑三，迅速混勻后在265nm測定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。

AAO活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

= 92.4×△A÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 92.4×△A÷W

ε：AsA在265nm處摩爾吸光系數為5.42×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm； V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；

T：催化反應時間（min），2min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

=184.8×△A÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 184.8×△A÷W

ε：AsA在265nm處摩爾吸光系數為5.42×10⁴ L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm； V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；

T：催化反應時間（min），2min。

注意事項:

配制好的試劑放在4℃保存，三天內使用完。