L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶（Gal LDH）活性測定試劑盒說明書

                                                微量法 100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑。Gal LDH位于線粒體內膜，負責催化植物體內AsA生物合成的最后一步，也是該途徑的關鍵酶之一，對植物體內AsA含量的積累起著至關重要的作用。

測定原理：

Gal LDH催化L-半乳糖內酯還原細胞色素C(Cyt c)，還原型Cyt c在550nm有吸收峰；測定還原型Cyt c增加速率，來計算Gal LDH活性。

自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入16mL蒸餾水，充分溶解。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解。

粗酶液提取：

照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。13000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

Gal LDH測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節(jié)波長到550nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。

3.依次在、微量玻璃比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL預熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于550nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A = A2﹣A1。

Gal LDH活性計算公式：

使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（Cpr×V樣）÷T

=578×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=578×△A ÷W

ε：還原型Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/ mol/cm；d：96孔板光徑(cm)，0.5cm；V反總：反應體系總體積，0.2mL=0.0002 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質含量BCA試劑盒；T：反應時間，2min。

注意事項:

試劑二和試劑三配制好后3天內使用完。