硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（TPX）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微量法 100T/96S

注　意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

TPX 屬于過(guò)氧化物酶家族，在體內(nèi)主要通過(guò)還原過(guò)氧化氫和一些氫過(guò)氧化物來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，功能與 GPX 類(lèi)似，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX 普遍存在于各種生物體內(nèi)，如酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和古細(xì)菌，在進(jìn)化上高度保守。 TPX 與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX 的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。

測(cè)定原理：

TPX 催化 H2O2 氧化二硫蘇糖醇（DTT），H2O2 的吸收波長(zhǎng)為 240nm，通過(guò)測(cè)定 240nm 吸光度的下降速率，即可計(jì)算出 TPX 活性。

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV板）、和蒸餾水

試劑組成和配制:

試劑一：液體 120mL×1 瓶，室溫保存。

試劑二：液體 20mL×1 瓶，- 20℃保存。

試劑三：液體 2mL×1 支，4℃。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

TPX 測(cè)定操作：

取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 4 μL 上清液，180 μL 試劑二，16 μL 試劑三，迅速混勻后于 240 nm 測(cè)定 10s 和 130s 吸光度，記為 A1 和 A2。

TPX 活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個(gè)酶活單位。TPX（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=573×(A1－A2)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個(gè)酶活單位。 TPX 活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個(gè)酶活單位。