硫氧還蛋白氧化還原酶（TrxR）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100T/96S

注 意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

TrxR 是一種 NADPH 依賴(lài)的包含 FAD 結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及 NADPH 共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR 與 GR 活性類(lèi)似，催化 GSSG 還原生成 GSH，是谷胱/甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。

測(cè)定原理：

TrxR 催化 NADPH 還原 DTNB 生成 TNB 和 NADP⁺，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定 412nm 波長(zhǎng)處 TNB 的增加速率，即可計(jì)算 TrxR 活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、可調(diào)節(jié)移液器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 120mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入 2mL 蒸餾水溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

TrxR 測(cè)定操作：

1.    分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412nm，用蒸餾水調(diào)零。

2.    試劑一在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）預(yù)熱 30min。

3.    空白管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 試劑二，20μL 試劑三，160μL 試劑一，迅速混勻后于 412 nm 測(cè)定 10 s 和 310 s 吸光度，記為 A1 和 A2。△A 空白管=A2-A1。

4.    測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μL 試劑二，20μL 試劑三，140μL 試劑一， 20μL 上清液，迅速混勻后于 412 nm 測(cè)定 10 s 和 310 s 吸光度，記為 A3 和 A4。△A 測(cè)定管

=A4-A3。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

TrxR 活性計(jì)算公式：

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T = 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=  147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶

活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣

總)÷T

= 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

=  147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）

ε：TNB 在 412nm 處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：

反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；

W     ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5 min。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活

單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

=   294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=  294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶

活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣

總)÷T

= 294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個(gè)酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T

=  294×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）

ε：TNB 在 412nm 處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5 min。

注意事項(xiàng)：

1.        測(cè)定前須先取 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，使得吸光值在 5min 內(nèi)程線性變化。哺乳動(dòng)物組織及血液制品 TrxR 活力測(cè)定時(shí)，一般須用蒸餾水稀釋 5 倍左右；測(cè)定過(guò)程操作須迅速。

2.        試劑二和試劑三配制好后 3 天內(nèi)使用完。

硫氧還蛋白氧化還原酶（TrxR）試劑盒僅供科研！